巨噬细胞存在于每个组织中，在组织稳态以及协调免疫系统对病原体和组织损伤的反应中发挥重要作用。巨噬细胞是极其多样化的，具有不同的个体发育，组织特异性表型，以及在炎症和修复中的不同功能。虽然最初被认为来源于血液单核细胞，但现在已知一些组织特异性的驻留巨噬细胞，例如小胶质细胞、Kupffer细胞、肺泡巨噬细胞和Langerhans细胞是胚胎来源的，并在一生中自我补充。最近的研究表明，许多器官中存在额外的组织巨噬细胞，这些巨噬细胞可大致分为2个或3个不同的亚群。虽然不同组织巨噬细胞亚群的确切功能尚不完全清楚，但它们与促进组织炎症、组织修复和组织纤维化等异常反应有关。在肺内，经典的组织定居巨噬细胞为肺泡巨噬细胞，定居于肺泡腔内。在肺实质内，可以在血管系统和大气道附近以及肺泡壁的间质中发现一种额外的组织巨噬细胞，称为间质巨噬细胞( Interstitial macrophage，IM )，IM可以分为两个或三个亚群，Notch通路在包括髓系细胞在内的许多系统的细胞分化中起着至关重要的作用。Notch受体有4种，Notch1-4，分别与5种不同的配体Jag1，2，Dll1，3，4相互作用。在髓系细胞中，已知Notch2信号对Esam + 2型传统树突状细胞( c DC2 )的发育和Ly6Chi经典单核细胞向巡游单核细胞的转化至关重要。在脾脏和心脏中，这种转换也抑制了单核细胞向组织的募集和随后的巨噬细胞分化。

scRNAseq ，CITE-Seq

1. 抑制Notch2可增加肺间质巨噬细胞的数量

Notch2是肺内杯状细胞转分化和炎性ILC2s形成所必需的。为了证实IMs的扩增是细胞固有的，而不是继发于其他细胞中的Notch2信号，我们产生了骨髓嵌合体，允许在造血或非造血隔室(图1e , f)中诱导Notch2的缺失。只有在骨髓供体细胞中敲除Notch2时，Notch2的缺失才会增加IMs的数量，提示Notch2对IMs的影响是造血室固有的(图1e )。为了证实Notch2阻断的效应是巨噬细胞谱系固有的，我们评估了混合骨髓嵌合体中的IM数量。将WT小鼠的骨髓与对照小鼠的骨髓按1：1的比例混合，同系标记用于追踪髓系细胞的起源(图1g )。处理后只有Notch2缺失的骨髓来源的IMs在肺中的数量增加(图1g )。因此，Notch2阻断内在地作用于单核/巨噬细胞谱系细胞，以扩大肺中的IM数量。

2. 单细胞分析IMs在稳定状态和Notch2阻断后的情况

进行聚类分析以识别不同的亚群，揭示了4个单核细胞簇( M1、M2、M3、M4)，3个AM簇( A1、A2、A3)和4个IM簇( I1、I2、I3、I4) (图2a )。簇M4，A2和I4主要存在于α Notch2处理的小鼠中，而M2仅存在于对照抗体处理的小鼠(图2a , b)中。有趣的是，M4群体位于单核细胞和突现簇I4之间的UMAP，表明M4可能代表中间群体(图2a )。Notch2阻断也诱导AMs表型由A1型向A2型转变。A2型AMs的特征是AM身份关键标记基因Car4表达量较高，为32，但RNA和抗体标记(图2c ,补充图2f)的AM标记Siglec F水平相似。在两种条件下都存在的较小种群A3被鉴定为增殖型AMs (图2c ,附图2e)。最后，对照组小鼠中几乎所有的IMs分离成I1，I2和I3簇。Cluster I1表达Lyve1、Folr2、Mrc1、CD163和CD209f (图2c )。与此相反，IP α Notch2处理的动物中超过80 %的IMs由cluster ( I4 ) (图2a , b)表示。该群体表达一些选择性激活相关基因，如Arg1和Chil3，以及Spp1，Fabp5，Gpnmb，S100a6和多个组织蛋白酶( Ctsb、Ctsd、Ctsk、Ctss) (图2c )。有趣的是，A2和M4群体也表达了一些标记，但程度较轻。这些基因均未在稳态IMs (附图2e)中高表达。

3. 单核源性的α Notch2扩大间质巨噬细胞数量

通过阻断Notch2诱导M4群，并将其定位在单核细胞和IMs之间的UMAP中，提示I4群来源于单核细胞。M4细胞通过我们的FACS和使用Immgen数据库均被鉴定为单核细胞，但没有用用于标记血管内细胞的α CD45 - APC抗体进行标记(图3a )。在对照小鼠中，我们没有鉴定出三种主要细胞类型( IM、AM、单核细胞,图3b ,附图3b)之间的任何细胞转换，这表明AMs和IMs是相对稳定的群体，单核细胞的任何潜在替代是一个罕见和/或缓慢的过程。然而，在Notch2阻断后，我们很容易识别单核细胞和扩增的α Notch2衍生的IM cluster I4之间的细胞转换，而不是从AMs (图3b )。

4. 局部阻断Notch2可诱导具有肺泡巨噬细胞样表型的I4型巨噬细胞

为了区分外周阻断Notch2对骨髓造血和肺内细胞的影响，我们在第0天和第7天通过被动气管内吸入( IT )直接将抗体注入气道，并在第14天使用sc RNAseq 评估肺巨噬细胞。在对照IT处理的小鼠中，我们检测到I4巨噬细胞数量的适度增加，这可能反映了对液体应用于肺的反应。相反，用α Notch2抗体IT处理增加了IMs的总数，大多数细胞表达相同的I4标记基因( Spp1、Gpnmb、Fabp5、Cd9和Arg1)(图4a - c )，为了更好地了解组成I4群体的特征，我们使用基于图的方法Hotspot37分析了特定的I4转录程序，该方法基于局部自相关和邻近细胞之间的共表达将基因组织成模块。为此，如前所述，将两个数据集( IT、IP)整合在一起，并使用IT / IP Notch2阻断的联合数据集(图5a - c )进行热点分析。这使得我们能够评估一个簇内基因表达的动态变化，并捕获不会自然分离到不同子簇的基因表达梯度。通过AM标记基因Ear2，Plet1，Wfdc21和Ltc4s的表达来定义模块I4d (图5a )。I4d信号在AMs ( A1-A3 )中最高，但也存在于IT诱导的I4细胞中，而不是IP阻断剂(图5b , c )诱导的I4细胞。事实上，更多的AM特异性模块I4d仅在与A2 AMs聚类最近的" AM-like " I4巨噬细胞中表达，进一步表明在IT而不是IP处理的小鼠(图5c)中AMs和I4巨噬细胞之间的潜在关系。

5. 在器官损伤模型中，抗Notch2诱导的IMs类似于巨噬细胞状态

从器官损伤数据集中对稳态IMs以及各自的未处理对照进行分类，结果表明这些研究中的绝大多数细胞可以被注释为属于簇I1，I2和I3。一小部分细胞可以归类为I4，这表明I4巨噬细胞是稳定状态(图6a , b和图2b)中一个真实但罕见的群体。组织损伤的公开数据集来自7个不同的研究，主要集中在不同的器官：肝脏41个，脂肪组织38个，骨骼肌42个，心脏43个，肺27个，44个，45个。在高脂饮食喂养的小鼠的附睾脂肪垫和肝脏中0.7 %和15 %的巨噬细胞被分类为I4型巨噬细胞(图6b )。在小鼠器官损伤模型中，包括梗死的心脏，创伤性肌肉损伤和几种不同的肺纤维化模型中，15-70 %的间质巨噬细胞可以分类为I4细胞(图6b )。我们将这些研究的IMs与IP或IT α Notch2的IMs进行比较，通过计算相似度得分，将所有研究整合在相同的PCA空间(附图6a , b)中。与insult条件相关的IM细胞与Notch2阻断后的IM具有较高的相似性(图6c )。在I4群体中，在组织损伤小鼠模型中鉴定的I4巨噬细胞比在对照小鼠(附图6c)中鉴定的I4细胞更类似于α Notch2诱导的I4细胞。有趣的是，在博来霉素诱导的肺纤维化的时间进程研究中发现，在给药后45天，类似I4型巨噬细胞的细胞持续扩增(图6d )。为了确定Notch信号在损伤后是否可能被调节，我们使用Cell ChatDB分析了在对照动物和博来霉素损伤后收集的全肺数据中的Notch受体- Notch配体相互作用。这一分析表明，在博来霉素作用后的IM簇中，Notch - Notch配体相互作用减弱(图6f )。Notch相互作用的丧失与I4巨噬细胞的出现相吻合，并支持在组织损伤和炎症期间体内Notch信号的丧失可能作为信号促进I4细胞状态的观点。

本研究发现Notch2信号阻断能够诱导肺部I4型巨噬细胞的增加，这些细胞在博来霉素诱导的肺损伤和SARS-CoV-2感染模型中显示出抗炎和抗纤维化的作用。实验结果表明，I4巨噬细胞并非纤维化的驱动因素，反而可能在减轻肺部纤维化和炎症中发挥保护作用，在过去几年中，单细胞转录组学方法的迅速采用为疾病的发病机制提供了深刻的见解，揭示了新的细胞状态，如在非适应性组织反应中存在的巨噬细胞。将这种细胞状态与病理反应的进展联系起来是很有诱惑力的，我们的结果表明，在许多器官损伤和人类疾病模型中看到的I4巨噬细胞本身并不是促纤维化的，甚至可能是保护性的。需要更精确的遗传工具和方法来剖析单个细胞状态在疾病中的作用。

参考文献：

Cruz Tleugabulova M, Melo SP, Wong A, Arlantico A, Liu M, Webster JD, Lau J, Lechner A, Corak B, Hodgins JJ, Garlapati VS, De Simone M, Korin B, Avraham S, Lund J, Jeet S, Reiss A, Bender H, Austin CD, Darmanis S, Modrusan Z, Brightbill H, Durinck S, Diamond MS, Schneider C, Shaw AS, Nitschké M. Induction of a distinct macrophage population and protection from lung injury and fibrosis by Notch2 blockade. Nat Commun. 2024 Nov 6;15(1):9575. doi: 10.1038/s41467-024-53700-9. PMID: 39505846; PMCID: PMC11541919.