产品内容：
提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存；
试剂二： 粉剂×1支，-20℃保存；临用前每支加入1.11mL双蒸水，充分溶解备用，分装后-20℃保存，避免反复冻融；
试剂三：液体6mL×1瓶，4℃保存；
试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入3mL双蒸水，充分混匀；
试剂五：粉剂×1瓶, 4℃保存；临用前加入8mL双蒸水，充分混匀；
试剂六：粉剂×1瓶, 4℃保存；临用前加入8mL双蒸水，充分混匀；
试剂七：液体8mL×1 瓶，室温保存。
标准品：液体1mL×1 支，4℃保存。10μmol/mL磷标准液。临用前用蒸馏水稀释40倍即0.25μmol/mL 磷标准液。
定磷试剂的配制：按H2O：试剂五：试剂六：试剂七=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。
注意：配试剂最好用新的烧杯、玻璃棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。
 
产品说明：
线粒体复合体Ⅴ又称F1F0-ATP合酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，由F1和F0两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成，也可逆过程水解ATP。此外，复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。
复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi，通过测定Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性。
试验中所需的仪器和试剂：
台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、复合体Ⅴ的提取：   
① 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1.0 mL提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
② 4 ℃ 600 g离心10min。
③ 将上清液移至另一离心管中，4 ℃ 11000 g离心15min。
④ 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅳ（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。
⑤ 在沉淀中加入400uL提取液，超声波破碎（功率20％，超声5秒，间隔10秒，重复15次），用于复合体Ⅳ酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。
二、测定步骤：
1、 可见分光光度计预热30min以上，调节波长至660nm，蒸馏水调零。
2、 操作表：
（1）酶促反应
试剂名称（μL）
对照管
测定管
标准管
试剂二
10
10
-
试剂三
40
40
-
 样品 
-
50
-
混匀， 37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确水浴30min
试剂四
20
20
-
样品
50
 
-
混匀，8000rpm，室温离心10min，取上清液
 
（2）定磷
上清液
40
40
40
定磷试剂
200
200
200
 
混匀，40℃水浴10min，尽快在660nm测定吸光值，分别记为A测定管、A对照管、A标准管，计算ΔA=A测定管-A对照管。
 
三、复合体Ⅴ活力单位的计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性（U/mg prot）=ΔA÷A标准×C标准×V酶促×1000÷（Cpr×V样品）÷T
=20×ΔA÷A标准÷Cpr。
C标准液：标准溶液浓度，0.25μmol/mL； 1000：1μmol=1000nmol；Cpr：样品蛋白浓度，mg/mL，需自行测定，推荐我公司BCA蛋白浓度测定试剂盒；V样品：样品体积，0.2mL；V酶促，酶促反应总体积，0.48mL；T：反应时间，30min。
注意事项：
1. 为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于1），可用蒸馏水稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。若ΔA大于0.4，需将样本稀释适当倍数（计算公式中乘以相应稀释倍数），使A1-A2 小于0.2，可提高检测灵敏度；若ΔA偏小，则可以通过增加加入的样品体积来提高灵敏度。
2. 由于提取液中含有蛋白，所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量（单独测量）。TUNEology 波长可调检测卡盒-->